Tinción de Ziehl Neelsen

Fundamento:

Las paredes celulares de ciertas bacterias contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50-90 átomos de C) que les confieren la propiedad de resistir a la decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistentes (o ácidorresistentes). Las micobacterias como Mycobacterium tuberculosis y M. marinum se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere de calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el calentamiento aumenta la energía cinética de las moléculas del colorante lo cual también facilita su entrada a las bacterias. Las bacterias que resisten la decoloración son de color rojo, sobre un color azul (que lo provee el colorante de contraste Azul de metileno).

Procedimiento:

Frotis:

1.         Colocar los frascos con las muestras en orden consecutivo de izquierda a derecha

2.       Poner las láminas en la mesa (en este caso dentro de la CSB) y numerarlas con los números correspondientes a las muestras usando 1/3 de la lámina al reverso (para que al momento de hacer la decoloración no se borre)

3.       Abrir el frasco de la muestra de manera firme y lenta

4.       Ver el contenido del frasco y obtener la parte más purulenta

5.       Con un palillo de madera escoger la porción más purulenta/sanguinolenta/sólida, no se debe batir demasiado la muestra

6.       Extender la muestra en un frotis de una capa no muy gruesa (sobre loso 2/3 de lámina sobrante) sin llegar a los bordes

7.       Si es necesario, desmenuzar las partículas grandes con las puntas del palillo de madera quebrado por la mitad

8.       Desechar el aplicador en un frasco de boca ancha con alcohol o cloro

9.       Dejar secar el frotis

10.    Tomar la lámina por el extremo numerado con la muestra hacia arriba, pasarla tres veces por la llama del mechero para fijar el frotis, dejar enfriar el frotis (2-3 min.)

Tinción:

1.         Cubrir todo el porta-objeto con fucsina filtrada

2.       Calentar hasta la emisión de vapores (aprox. 5 min.)

3.       Lavar con agua (poniendo la lámina de una manera inclinada para evitar barrer la muestra) y escurrir

4.       Cubrir con solución decolorante durante 2 min.

5.       Lavar con agua (poniendo la lámina de una manera inclinada para evitar barrer la muestra) y escurrir

6.       Cubrir con azul de metileno de 45seg.-1min.

7.       Lavar con agua y luego poner en la tabla de secado (para escurrir)

Reporte de resultados:

Informe	Número de BAAR
Negativo (-)	No se observaron BAAR en 100 campos observados (C.O.)
No. Exacto de bacilos	Se observan de 1-9 BAAR en 100 C.O.
Positivo (1+)	Se observa de 10-99 BAAR en 100 C.O.
Positivo (2+)	Se observa de 1-10  BAAR x campo en 50 C.O.
Positivo (3+)	Se observa más de 10 BAAR x campo en 20 C.O.