domingo, 17 de agosto de 2014

Características Generales de las Enterobacterias - Enterobacteriaceae

La familia Enterobacteriaceae constituye un grupo grande y heterogéneo de bacterias Gramnegativas (De más de 30 géneros). Reciben su nombre por la localización habitual como saprófitos en el tubo digestivo, aunque se trata de gérmenes ubicuos, encontrándose de forma universal en el suelo, el agua y la vegetación, así como formando parte de la flora intestinal normal de muchos animales además del hombre.
                Escherichia coli, es microorganismo más prevalente de esta familia, es una bacteria prototípicas sometidas a estudio.
  • ·         Grupo muy homogéneo de gamma Proteobacterias
  • ·         Bacilos Gram negativos no esporulados
  • ·         Anaerobios facultativos
  • ·         Oxidasa negativo y Catalasa positivo
  • ·         Fermentadores de azúcares: Ácido mixta (E. coli, Shigella, Salmonella) o
  • ·         Butilenglicólica ( Enterobacter, Klebsiella, Serratia )
  • ·         Productores de Toxinas ( Exo y Endotoxinas)
  • ·         Indicadores de contaminación fecal ( Colimetría)
  • ·         Importancia médica
  • ·         Distribución universal en suelos, agua, plantas, frutos , animales….

·         Géneros representativos: Salmonella, Escherichia, Shigella, Proteus Serratia, Yersinia, Klebsiella, Enterobacter

Epidemiología: En los individuos hospitalizados e inmunodeprimidos (incluyendo pacientes alcohólicos y diabéticos), en especial los pacientes que reciben tratamiento antibiótico, hay colonización por  Enterobacteriaceae, además de en el tubo digestivo, en la orofaringe, el aparato genitourinario y la piel. Las infecciones por estas bacterias son frecuentes en estos contextos. La proporción de aislados resistentes a múltiples antimicrobianos, incluidos aquellos que producen B-lactamasas de espectro extendido, ha aumentado de forma ininterrumpida, de modo que casi todo los aislados nosocomiales, muchos de los aislados adquiridos en la comunidad, son ahora resistentes a varias clases importantes de antimicrobianos.

Estructura: Las enterobacterias poseen una estructura antigénica muy compleja. Mencionaremos los más importantes
  • Antígeno O o somático, es parte de un lipopolisacárido que se encuentra en la pared celular. Este lipopolisacárido tiene tres fracciones:
  • ·         Región uno: oligosacárido que contiene al Antígeno O.
  • ·         Región dos: polisacárido central constante para un género determinado.
  • ·         Región tres: dado por el lípido A, que constituye la endotoxina.
  • Antígeno K o capsular, que está presente sólo en algunas bacterias capsuladas como Klebsiella pneumoniae y Escherichia coli.
  • Antígeno Vi es un polisacárido que rodea a la bacteria sin llegar a ser una cápsula y es característico de algunas especies de Salmonella.
  • Antígeno H o flagelar son proteicos, es específico de especie y está presente sólo en las especies móviles.
  • Antígeno F o fimbrial: presente en las fimbrias. Son de naturaleza proteica

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Factores determinantes de Patogenicidad
·         La cápsula tiene propiedades de adhesinas y es antifagocítica
·         Las fimbrias permiten la adherencia a la célula huésped e impiden el barrido por las barreras mecánicas de defensa del organismo
·         Algunas especies producen exoenzimas como ureasa, gelatinasa, lipasa, desoxirribonucleasa, las cuales actúan permitiendo la sobrevida de la bacteria dentro del órgano afectado
·         Debido a que el hierro es indispensable para ciertas funciones de las bacterias, estos microorganismos producen aerobactinas que permiten la captación de hierro desde el medio
·         Todas las enterobacterias poseen el lipopolisacárido de pared, el cual tiene acción de endotoxina, la cual se libera al destruirse la bacteria
·         Exotoxinas: no todas las especies la producen. Sólo son producidas por las patógenas obligadas y poseen efectos específicos.

Enterobacterias Patógenas Oportunistas
Dentro de este grupo se incluyen aquellas especies que forman parte de la flora normal del hombre y los animales, están presentes en el suelo, el agua y las plantas. Producen infección cuando salen de su hábitat o hay alteraciones de las defensas locales. Los géneros oportunistas que con mayor frecuencia se aíslan de muestras clínicas son Escherichia, Klebsiella. Serratia, Enterobacter, Citrobacter, Proteus, Morganella, Providencia, etc.
Estas bacterias producen infecciones extraintestinales como infecciones urinarias, sepsis, meningitis, abscesos, neumonías, otitis, sinusitis, etc.

Escherichia
Dentro de género la especia de mayor importancia es Escherichia coli. E. coli se encuentra en número muy elevado en el contenido intestinal y tiene la capacidad de suprimir el crecimiento de microorgenismos proteolíticos debido a la liberación de bacteriocinas (colicinas), sustancias con acción bactericida, y están relacionado con la síntesis de vitamina K. Son fermentadoras de lactosa y móviles.
E. coli es el principal agente etiológico de infecciones urinarias tanto en pacientes internados como ambulatorios ya que posee fimbrias capaces de adherirse al epitelio urinario y colonizarlo. Produce además peritonitis, abscesos, meningitis, endocarditis, neumonías nosocomiales, etc.

Klebsiella
Éste género está muy extendido en la naturaleza, en la tierra, en el agua, polvo, leche, alimentos. También se las ve como organismos saprófitos de las vías respiratorias y del tracto digestivo del hombre y los animales.
Son microorganismos capsulados, inmóviles, fermentadores de lactosa, que fermenta la glucosa mediante la vía de fermentación del 2-3 butanodiol al igual que los del género Enterobacter.
Dentro de este género, la especie más importante es K. pneumoniae. Es la especie tipo y produce infecciones urinarias, respiratorias y sepsis, siendo frecuentemente involucrada en brotes de infecciones hospitalarias. En algunos hospitales Klebsiella ha desplazado a  E. coli como agente etiológico de infecciones intrahospitalarias. Existen dos subespecies, Klebsiella rhinoescleromatis y K. ozaenae que se relacionan con otitis y rinitis de olor fétido con destrucción granulomatosa de la nariz y la faringe.

Proteus
Éste género está muy difundido en la naturaleza, se lo encuentra en el suelo, agua, aguas servidas, materiales de animales en descomposición, tracto intestinal del hombre, etc. Juega un papel importante en la descomposición de los cadáveres.
Se presenta con flagelos perítricos muy abundantes que hacen que “hormiguee” sobre la superficie de un medio sólido de cultivo. Dentro del género Proteus las especies más importantes son  P. mirabilis y P. vulgaris
Estos microorganismos son lactosa negativos y son productores de ureasa, factor de patogenicidad en la producción de infecciones urinarias ya que esta enzima desdobla a la urea (muy abundante en la orina), en amoníaco y dióxido de carbono. El amoníaco es tóxico para las células con lo que se produce la irritación del epitelio urinaria.

Shigella
Incluye 4 especies pertenecientes a 4 grupos serológicos O:
Grupo A: S. dysenteriae
Grupo B: S. flexneri
Grupo C: S. boydii
Grupo D: S. sonnei

Estas bacterias son todas inmóviles. Producen diarrea relacionada con la ingestión de agua y alimentos contaminados con materia fecal, pudiendo transmitirse además de persona a persona por la vía ano-mano-boca. Luego de ingerida, la bacteria se adhiere al eritrocito, induce la captación por la célula intestinal mediante reacomodamiento del citoesqueleto (endocitosis inducida). Una vez internalizada, la bacteria destruye la vacuola endocítica y se reproduce en el citoplasma, invade células vecinas y producen lesión en el epitelio dando como resultado una materia fecal con sangre, moco y pus (diseriforme). Secretan además la toxina Shiga, por lo que también pueden desencadenar un Síndrome Urémico Hemolítico.

Salmonella
En este género se describen 2 especies: S. bongori y S. entérica. Dentro de la especie S. entérica  están incluídas en 6 subespecies: S. entérica, S. salamae, S. arizonae, S. houtanae, S. diarizonae, S. indica.
Salmonella entérica subespecie enterica es la única descripta como patógena humana. Dentro de este género se encuentran más de 2000 serotipos teniendo en cuenta sus antígenos O, H y Vi. Los serotipos se denominan con letra mayúscula normal (no en redondilla) y generalmente indican el lugar del primer aislamiento.
Estas bacterias no fermentan la lactosa, la mayoría de los serotipos son móviles y producen diarrea relaciona con ingestión de alimentos contaminados con materia fecal, pudiendo dar complicaciones como sepsis, neumonías, abscesos
Sus factores de patogenicidad son:
·         Invasividad: es una bacteria inminentemente enteroinvasora. Salmonella atraviesa el epitelio del intestino delgado pasando los tejidos subepiteliales de la mucosa y submucosa.
·         Endotoxina: Fracción tres del lipopolisacárido de la pared celular. Se ha visto que actúa tanto en la fiebre tifoidea como en los casos de septicemias.
·         Antígeno Vi: solo está presente en Salmonella Tiphy, Salmonella Paratiphy C y Salmonella Dublin. Se relaciona con la sobrevida dentro de los macrófagos
·         Enterotoxina: no es constante y sólo se la ve en algunos serotipos.

La acción patógena de Salmonella puede dividirse en tres tipos de cuadros clínicos:
·         Septicemia: principalmente en pacientes hospitalizados o inmunosuprimidos se producen septicemias graves cuyas lesiones metastásicas son los abscesos, osteomelitis, meningitis, endocarditis, etc.
·         Gastroenteritis: Las Salmonellas son invasivas. Se adhieren al eritrocito, inducen la endocitosis, se multiplican en el interior de la vesícula endocítica y a partir de allí se diseminan hacia células vecinas. Como consecuencia de su acción se destruye el epitelio y llegan gran cantidad de polimorfonucleares dando como resultado heces con moco y pus
·         Fiebres entéricas: Salmonella Tiphy, Salmonella Paratiphy A y Salmonella Paratiphy B producen fiebre entérica. Las Salmonellas se ingieren con el agua y alimentos contaminados. Desde  la boca llegan al intestino delgado, atraviesan la mucosa intestinal y se alojan en las placas de Peyer y ganglios mesentéricos, multiplicándose activamente durante unos doce días (que es el período de incubación). De los ganglios pasan al conducto torácico a través del cual llegan a la sangre. De la sangre pasan al bazo, médula ósea, hígado y vesícula biliar, desde donde llegan al intestino delgado.
Yersinia
Este género llamado antes Pasturella tiene 3 especies importantes: Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia enterocolítica.

Yersinia pestis es el agente etiológico de la peste. La peste es una zoonosis, o sea que la sufre un animal (la rata) y esta la transmite al hombre por medio de las pulgas. La especia de pulga más importante es la Xenopsylla cheopis que adquiere a la  Yersinia  al picar a un animal con bacteremia y al picar a un hombre las inyectan con la sangre del animal enfermo. Se conocen 3 formas clínicas de la peste:
·         Forma bubónica: Es la forma más frecuente. La pulga pica generalmente en los miembros inferiores y al progresar por los linfáticos producen los típicos bubones (que son los ganglios inguinales infectados e infartados). La infección toma solamente un ganglios, el cual se hipertrofia y se hace doloroso. Además, puede supurar liberando un pus que contiene a las Yersinia. Si esta supuración no se produce, la enfermedad evoluciona hasta la forma septicémica de la peste.
·         Forma septicémica: Se manifiesta como una sepsis gravísima de tipo hemorrágico. Puede producirse como una forma primaria o bien ser secundaria a la forma bubónica. En muchos casos la evolución es fulminante.
·         Forma pulmonar: Puede ser una forma primaria o secundaria a una forma bubónica. La forma primaria se debe a un contagio interhumano directo. Por los esputos de los enfermos se liberan las Yersinia  y suelen acompañarse de daño del SNC.
Yersinia enterocolítica  produce diarrea por enteroinvasión sobre todo en el colon. Al igual que la Y. pseudotuberculosis es ureasa positiva. (Y. pestis es ureasa  negativa). Afecta sobre todo a niños, siendo más frecuente en invierno. La vía de transmisión es fecal-oral. Se produce un compromiso ganglionar intenso. La complicación más grave es la septicemia aunque es poco frecuente

Pruebas diagnósticas:
Dentro de las pruebas más utilizadas para la identificación de estas bacterias están:
Realización de pruebas bioquímicas, que mediante un sustrato presente en el medio y una enzima de la bacteria nos presentan una reacción visible. Dentro de estas son la producción de indol, descarboxilación de lisina y ornitina,etc. Siempre debe sembrarse en medio selectivos como Agar EMB, Agar McConkey y Agar SS. La identificación serológica es útil para subtipificar cepas de E. coli, Salmonella  y Shigella, en algunos casos para determinar la especie y el serotipo y en otros para estudios epidemiológicos.

sábado, 9 de agosto de 2014

Pruebas Bioquímicas para Enterobacterias


Las pruebas bioquímicas permiten determinar las características metabólicas de las bacterias objeto de identificación.
Algunas de estas pruebas son técnicas rápidas, ya que evalúan la presencia de una enzima preformada y su lectura varía entre unos segundos hasta unas pocas horas. Otras pruebas requieren para su lectura el crecimiento del microorganismo con una incubación previa de 18 a 48h; a este grupo pertenecen la mayoría de las pruebas que detectan componentes metabólicos o aquellas que determinan la sensibilidad de un microorganismo a una sustancia dada tras cultivo en medios de identificación que contienen el sustrato a metabolizar.
La forma usual de detectar una enzima se basa en el principio de que si está presente, utilizara un sustrato determinado que ha sido puesto adrede en el medio de cultivo o en una prueba bioquímica determinada. Los productos terminales de la acción enzimática son detectados a través de indicadores de PH o por el aparecimiento de pigmentos que hacen virar el color del medio.

Funciones de los componentes básicos de los medios de cultivos:
·         Sustrato: Reacciona con la enzima específica y da origen a productos terminales que pueden ser ácidos o alcalinos.
·         Indicador de PH: Detecta productos terminales de la utilización del sustrato. Son colorantes añadidos para indicar los cambios que hay en el medio durante el crecimiento de los microorganismos. Estos indicadores son sensibles a los cambios de PH, por lo tanto, los virajes de color de los mismos indican de manera indirecta la presencia de productos terminales del empleo e sustrato. 
·         Nutrientes: La mayoría de las bacterias no crecerán solo con la presencia del sustrato básico, por lo que se requiere agregar diversos nutrientes que varían, dependiendo de los requerimientos de cada bacteria.
·         Inhibidores: Son utilizados más en medios selectivos iníciales, pero hay que tener en cuenta que no todos los microorganismos deseados serán inhibidos y no todos los deseados crecerán.

Fermentación de la lactosa en Agar McConkey
Fundamento: Es un medio selectivo diferencial que permite determinar si las bacterias Gramnegativas fermenta o no la lactosa. Las sales  biliares y el cristal violeta inhiben el crecimiento de los Grampositivos. Las colonias de bacterias que fermentan la lactosa son rosadas y pueden estar rodeadas de una zona de precipitados de sales biliares, el cual es debido a una caída en el pH por la fermentación de la lactosa. Las colonias que no fermentan la lactosa permanecen incoloras.

Lectura e interpretación: Las bacterias fermentadoras de lactosas se observan de color rosado con o sin zona de precipitado alrededor, mientras que las no fermentadoras de lactosa se observan incoloras o transparentes

TSI: Agar Tres Azúcares o Triple Azúcares y Hierro.
Fundamento: Este medio se utiliza para determinar la capacidad de los bacilos gramnegativos para fermentar lactosa, sacarosa y glucosa, así como para determinar su capacidad de producir H2S (ácido sulfúrico) y gas.
El tubo contiene dos cámaras de reacción, en la parte inclinada (pico de flauta) se fermenta la lactosa y la sacarosa y en la parte profunda se fermenta la glucosa. Se puede fermentar los tres azucares o uno de ellos lo cual dependerá del microorganismo que se estudie.
Lectura e interpretación:
·         Kalium-kalium K/K: Se observa tubo color rojo, no fermenta ninguno de los azúcares.
·         Acido-Acido A/A: Se observa todo el tubo de color amarillo, fermenta la glucosa, lactosa y sacarosa, con producción o no de gas, la cual se representa con (G) si es abundante y (g) si es poca.
·         Kalium-Acido K/A: Se observa el tubo en la parte inclinada color rojo y amarillo el fondo, fermenta solo la glucosa, con producción o no de gas, la cual se representa con (G)  si es abundante y (g) si es poca.
·         Kalium- Acido K/A+: Se observa el tubo parte inclinada rojo y amarillo el fondo, con enecrecimiento, fermenta la glucosa, con producción de H2S la cual se representa por (+), con producción o no de gas, la cual se representa con (G)  si es abundante y (g) si es poca.

LIA: Lisina Hierro Agar.
Fundamento: Es un medio para detectar enzimas que descarboxilan o desaminan la lisina en bacilos gramnegativos. Adicionalmente detecta enzimas que producen sulfuro de hidrógeno y gas proveniente de la glucosa.
No existen Enterobacterias que posean las dos enzimas (descarboxilasa y desaminasa de la lisina) por lo que sólo se tiene que observar, o una de ambas reacciones o la ausencia de ambas.

Lectura e interpretación:
·         Kalium- Kalium K/K: Se observa tubo color violeta, descarboxilación de la lisina con producción o no de gas, la cual se representa con (G) si es abundante y (g) si es poca. Se interpreta Lisina Positiva.
·         Rojo-Acido R/A: Se observa tubo color rojo superficie y amarillo fondo, desaminación de la lisina, con producción o no de gas, la cual se representa con (G) si es abundante y (g) si es poca. Se interpreta Lisina desaminasa.
·         Kalium-Kalium K/K+: Se observa tubo color violeta superficie y negro fondo, descarboxilación de lisina, con producción de H2S la cual se representa por (+), con producción o no de gas, la cual se representa con (G) si es abundante y (g) si es poca.
·         Kalium-Acido K/A: Se observa tubo color violeta en la superficie y amarillo en el fondo, el color amarillo se debe a la fermentación de glucosa. Puede haber o no producción de gas. Se interpreta Lisina negativa. Quiere decir que no descarboxilo ni desamino la lisina.

Nota: Es importante diferenciar las diferentes reacciones del tubo de LIA, conocer cuando el microorganismo es lisina positiva, lisina negativa y lisina desaminasa. Las cuales serán de mucha utilidad junto con la fermentación de lactosa en el plato de MacConkey para realizar montaje del resto de bioquímica de identificación.

MIO:Movilidad, Indol, Ornitina.
Fundamento: Es un medio que se utiliza para determinar la presencia de flagelos, así como las enzimas descarboxilasa de ornitina y triptofanasa. Por lo tanto, sirve para determinar la movilidad, descarboxilación de la ornitina y producción de indol.
Algunas bacterias poseen flagelos y otras carecen de ellos. Este medio ayuda a diferenciar las móviles de las no móviles.
Lectura e interpretación: La movilidad se observa por turbidez del medio, si sólo se observa crecimiento en la estría realizada es negativa. Si la bacteria posee la enzima triptofanasa, al agregar el reactivo (3 gotas) de Kovac (p-dimetilaminobenzaldehido) o Erlich se observa un anillo color rosado intenso. La presencia de enzima decarboxilasa de Ornitina, desdobla la Ornitinaa putrescina, lo que intensifica el color violeta del medio fondo del tubo. Un viraje del violeta al amarillo se interpreta ornitina negativo.

Urea deCrhistensen:
Fundamento: Detecta la presencia de la enzima ureasa. Cuando la bacteria tiene la enzima, la urea es desdoblada a amonio y CO2. El amonio alcaliniza el medio haciendo virar el indicador al rosado intenso.
Lectura e interpretación: Una color rosado intenso indica reacción positiva, si el medio conserva su color original de amarillo pálido o un poco más intenso indica reacción negativa.

Citrato de Simons:
Fundamento: Determina la capacidad de un microorganismo de utilizar el citrato como única fuente de carbono.
Lectura e interpretación: Un viraje de color verde al azul marino y crecimiento en la superficie da una reacción positiva, de lo contrario es negativa

Malonato (caldo malonato fenilalanina):
Fundamento: Evalúa la capacidad del microorganismo de utilizar el malonato como única fuente  de carbono y la desaminación de la fenilalanina, en forma combinada.Las Enterobacterias no tienen la capacidad enzimática de realizar las dos reacciones simultáneamente, por lo que, o se observa la utilización del malonato o la desaminación de la lisina.
Lectura e interpretación: Un viraje de color verde al azul, da una reacción positiva, de lo contrario es negativa.


Rojo de Metilo (RM) - VoguesProskauer (VP):
Fundamento:
VP: Capacidad de un microorganismo de producir un producto final neutro, el acetilmetilcarbinol (acetoína), a partir de la fermentación de la glucosa.
RM: Comprobar la capacidad de un microorganismo de producir y mantener estables productos terminales ácidos de la fermentación de la glucosa.
Lectura e interpretación:
El RM es positivo si se observa un anillo de color rojo en la superficie del medio al agregar 2gts de reactivo rojo de metilo.

El VP es positivo si se observa un anillo de color zapote intenso en la superficie del medio. Al agregar 4gts de KOH al 40% y 6gts de alfa naftol.

TINCIÓN DE GRAM



La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes usados en el laboratorio bacteriológico y microbiológico para el examen directo de gran variedad de géneros bacterianos razón por la cual, se debe estar perfectamente familiarizado. Su utilidad práctica es indiscutible
 Y en el trabajo microscópico rutinario de microbiología las referencias a la morfología celular bacteriana como: cocos, bacilos, positivos, negativos, etc. se basan justamente en la tinción de Gram.
                Esta tinción se denomina así en honor al bacteriólogo danés Christian Gram, quien la desarrolló en 1844. Sobre las bases de su reacción, clasificó las bacterias en dos grandes grupos: las Grampositivas, que retienen el colorante primario (cristal violeta) y se observan de color azul obscuro o púrpura y las Gramnegativas, que son decoloradas, esto es que pierden el colorante primario y subsecuentemente toman el colorante de contraste safranina observándose de color rojo o rosa. 

En este caso los términos positivo y negativo no tienen nada que ven con carga eléctricas, sino simplemente designan dos grupos morfológicos distintos de bacterias.

Preparación del frotis:
·         Tome un portaobjetos y limpie con papel absorbente una de sus caras a fin de eliminar la grasa.
·         Marque en el reverso de la lámina un área ovalada aprox. de 1cm de diámetro y 2cm de largo y en el borde el número y tipo de muestra.
·         Gire la lámina y coloque una gotita de solución salina estéril sobre el área circular marcada al reverso de la lámina.
·         Con un aplicador de madera tome una colonia a partir del microorganismo a estudiar. Los frotis delgados son los mejores resultados.
·         Fíjela al calor, pasándola ligeramente por la llama, no calentar excesivamente. Una buena indicación del grado de calentamiento, es que al tocar el reverso de la lámina con su mano no debe quemarse
·         Coloque la lámina en el puente de tinción

Técnica de tinción:
·         Colóquese los guantes y ubicar las láminas extendidas y fijarlas en una bandeja adecuada y cubrir su superficie con cristal violeta por un minuto. Lavar con agua destilada y escurrir,
·         Cubra la superficie de la lámina con la solución de Lugol por un minuto. Lavar con agua destilada y escurrir
·         Decolorar con Alcohol-acetona hasta que los bordes del frotis no desprenda más color azul (30 segundos). Lavar con agua destilada y escurrir.
·         Nota: Este es el paso más importante de la coloración ya que una excesiva adición del alcohol-acetona permite la salida del colorante primario de las células grampositivas.
·         Cubrir las láminas con safranina por 1 minuto. Lavar con agua destilada, escurrir y dejar secar a temperatura ambiente.

Observación  bajo el microscopio
La tinción de Gram aporta dos ideas básicas para la identificación “taxonómica” de las bacterias: la primera es el color que adquieren tras la tinción y la segunda es la forma que presentan las células bacterianas.
·         Colocar una gota de aceite de inmersión sobre las láminas teñidas y secas, examinaras bajo un microscopio de luz, utilizando el objetivo de inmersión (100X)

·         Observar varios campos hasta encontrar aquel, donde las células están adecuadamente separadas, para permitir la visualización de la morfología