Pruebas Bioquímicas para Enterobacterias

Las pruebas bioquímicas permiten determinar las características metabólicas de las bacterias objeto de identificación.

Algunas de estas pruebas son técnicas rápidas, ya que evalúan la presencia de una enzima preformada y su lectura varía entre unos segundos hasta unas pocas horas. Otras pruebas requieren para su lectura el crecimiento del microorganismo con una incubación previa de 18 a 48h; a este grupo pertenecen la mayoría de las pruebas que detectan componentes metabólicos o aquellas que determinan la sensibilidad de un microorganismo a una sustancia dada tras cultivo en medios de identificación que contienen el sustrato a metabolizar.

La forma usual de detectar una enzima se basa en el principio de que si está presente, utilizara un sustrato determinado que ha sido puesto adrede en el medio de cultivo o en una prueba bioquímica determinada. Los productos terminales de la acción enzimática son detectados a través de indicadores de PH o por el aparecimiento de pigmentos que hacen virar el color del medio.

Funciones de los componentes básicos de los medios de cultivos:

·         Sustrato: Reacciona con la enzima específica y da origen a productos terminales que pueden ser ácidos o alcalinos.

·         Indicador de PH: Detecta productos terminales de la utilización del sustrato. Son colorantes añadidos para indicar los cambios que hay en el medio durante el crecimiento de los microorganismos. Estos indicadores son sensibles a los cambios de PH, por lo tanto, los virajes de color de los mismos indican de manera indirecta la presencia de productos terminales del empleo e sustrato. 

·         Nutrientes: La mayoría de las bacterias no crecerán solo con la presencia del sustrato básico, por lo que se requiere agregar diversos nutrientes que varían, dependiendo de los requerimientos de cada bacteria.

·         Inhibidores: Son utilizados más en medios selectivos iníciales, pero hay que tener en cuenta que no todos los microorganismos deseados serán inhibidos y no todos los deseados crecerán.

Fermentación de la lactosa en Agar McConkey

Fundamento: Es un medio selectivo diferencial que permite determinar si las bacterias Gramnegativas fermenta o no la lactosa. Las sales  biliares y el cristal violeta inhiben el crecimiento de los Grampositivos. Las colonias de bacterias que fermentan la lactosa son rosadas y pueden estar rodeadas de una zona de precipitados de sales biliares, el cual es debido a una caída en el pH por la fermentación de la lactosa. Las colonias que no fermentan la lactosa permanecen incoloras.

Lectura e interpretación: Las bacterias fermentadoras de lactosas se observan de color rosado con o sin zona de precipitado alrededor, mientras que las no fermentadoras de lactosa se observan incoloras o transparentes

TSI: Agar Tres Azúcares o Triple Azúcares y Hierro.

Fundamento: Este medio se utiliza para determinar la capacidad de los bacilos gramnegativos para fermentar lactosa, sacarosa y glucosa, así como para determinar su capacidad de producir H₂S (ácido sulfúrico) y gas.

El tubo contiene dos cámaras de reacción, en la parte inclinada (pico de flauta) se fermenta la lactosa y la sacarosa y en la parte profunda se fermenta la glucosa. Se puede fermentar los tres azucares o uno de ellos lo cual dependerá del microorganismo que se estudie.

Lectura e interpretación:

·         Kalium-kalium K/K: Se observa tubo color rojo, no fermenta ninguno de los azúcares.

·         Acido-Acido A/A: Se observa todo el tubo de color amarillo, fermenta la glucosa, lactosa y sacarosa, con producción o no de gas, la cual se representa con (G) si es abundante y (g) si es poca.

·         Kalium-Acido K/A: Se observa el tubo en la parte inclinada color rojo y amarillo el fondo, fermenta solo la glucosa, con producción o no de gas, la cual se representa con (G)  si es abundante y (g) si es poca.

·         Kalium- Acido K/A+: Se observa el tubo parte inclinada rojo y amarillo el fondo, con enecrecimiento, fermenta la glucosa, con producción de H₂S la cual se representa por (+), con producción o no de gas, la cual se representa con (G)  si es abundante y (g) si es poca.

LIA: Lisina Hierro Agar.

Fundamento: Es un medio para detectar enzimas que descarboxilan o desaminan la lisina en bacilos gramnegativos. Adicionalmente detecta enzimas que producen sulfuro de hidrógeno y gas proveniente de la glucosa.

No existen Enterobacterias que posean las dos enzimas (descarboxilasa y desaminasa de la lisina) por lo que sólo se tiene que observar, o una de ambas reacciones o la ausencia de ambas.

Lectura e interpretación:

·         Kalium- Kalium K/K: Se observa tubo color violeta, descarboxilación de la lisina con producción o no de gas, la cual se representa con (G) si es abundante y (g) si es poca. Se interpreta Lisina Positiva.

·         Rojo-Acido R/A: Se observa tubo color rojo superficie y amarillo fondo, desaminación de la lisina, con producción o no de gas, la cual se representa con (G) si es abundante y (g) si es poca. Se interpreta Lisina desaminasa.

·         Kalium-Kalium K/K+: Se observa tubo color violeta superficie y negro fondo, descarboxilación de lisina, con producción de H2S la cual se representa por (+), con producción o no de gas, la cual se representa con (G) si es abundante y (g) si es poca.

·         Kalium-Acido K/A: Se observa tubo color violeta en la superficie y amarillo en el fondo, el color amarillo se debe a la fermentación de glucosa. Puede haber o no producción de gas. Se interpreta Lisina negativa. Quiere decir que no descarboxilo ni desamino la lisina.

Nota: Es importante diferenciar las diferentes reacciones del tubo de LIA, conocer cuando el microorganismo es lisina positiva, lisina negativa y lisina desaminasa. Las cuales serán de mucha utilidad junto con la fermentación de lactosa en el plato de MacConkey para realizar montaje del resto de bioquímica de identificación.

MIO:Movilidad, Indol, Ornitina.

Fundamento: Es un medio que se utiliza para determinar la presencia de flagelos, así como las enzimas descarboxilasa de ornitina y triptofanasa. Por lo tanto, sirve para determinar la movilidad, descarboxilación de la ornitina y producción de indol.

Algunas bacterias poseen flagelos y otras carecen de ellos. Este medio ayuda a diferenciar las móviles de las no móviles.

Lectura e interpretación: La movilidad se observa por turbidez del medio, si sólo se observa crecimiento en la estría realizada es negativa. Si la bacteria posee la enzima triptofanasa, al agregar el reactivo (3 gotas) de Kovac (p-dimetilaminobenzaldehido) o Erlich se observa un anillo color rosado intenso. La presencia de enzima decarboxilasa de Ornitina, desdobla la Ornitinaa putrescina, lo que intensifica el color violeta del medio fondo del tubo. Un viraje del violeta al amarillo se interpreta ornitina negativo.

Urea deCrhistensen:

Fundamento: Detecta la presencia de la enzima ureasa. Cuando la bacteria tiene la enzima, la urea es desdoblada a amonio y CO_2. El amonio alcaliniza el medio haciendo virar el indicador al rosado intenso.

Lectura e interpretación: Una color rosado intenso indica reacción positiva, si el medio conserva su color original de amarillo pálido o un poco más intenso indica reacción negativa.

Citrato de Simons:

Fundamento: Determina la capacidad de un microorganismo de utilizar el citrato como única fuente de carbono.

Lectura e interpretación: Un viraje de color verde al azul marino y crecimiento en la superficie da una reacción positiva, de lo contrario es negativa

Malonato (caldo malonato fenilalanina):

Fundamento: Evalúa la capacidad del microorganismo de utilizar el malonato como única fuente  de carbono y la desaminación de la fenilalanina, en forma combinada.Las Enterobacterias no tienen la capacidad enzimática de realizar las dos reacciones simultáneamente, por lo que, o se observa la utilización del malonato o la desaminación de la lisina.

Lectura e interpretación: Un viraje de color verde al azul, da una reacción positiva, de lo contrario es negativa.

Rojo de Metilo (RM) - VoguesProskauer (VP):

Fundamento:

VP: Capacidad de un microorganismo de producir un producto final neutro, el acetilmetilcarbinol (acetoína), a partir de la fermentación de la glucosa.

RM: Comprobar la capacidad de un microorganismo de producir y mantener estables productos terminales ácidos de la fermentación de la glucosa.

Lectura e interpretación:

El RM es positivo si se observa un anillo de color rojo en la superficie del medio al agregar 2gts de reactivo rojo de metilo.

El VP es positivo si se observa un anillo de color zapote intenso en la superficie del medio. Al agregar 4gts de KOH al 40% y 6gts de alfa naftol.