TINCIÓN DE GRAM

La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes usados en el laboratorio bacteriológico y microbiológico para el examen directo de gran variedad de géneros bacterianos razón por la cual, se debe estar perfectamente familiarizado. Su utilidad práctica es indiscutible

 Y en el trabajo microscópico rutinario de microbiología las referencias a la morfología celular bacteriana como: cocos, bacilos, positivos, negativos, etc. se basan justamente en la tinción de Gram.

                Esta tinción se denomina así en honor al bacteriólogo danés Christian Gram, quien la desarrolló en 1844. Sobre las bases de su reacción, clasificó las bacterias en dos grandes grupos: las Grampositivas, que retienen el colorante primario (cristal violeta) y se observan de color azul obscuro o púrpura y las Gramnegativas, que son decoloradas, esto es que pierden el colorante primario y subsecuentemente toman el colorante de contraste safranina observándose de color rojo o rosa. 

En este caso los términos positivo y negativo no tienen nada que ven con carga eléctricas, sino simplemente designan dos grupos morfológicos distintos de bacterias.

Preparación del frotis:

·         Tome un portaobjetos y limpie con papel absorbente una de sus caras a fin de eliminar la grasa.

·         Marque en el reverso de la lámina un área ovalada aprox. de 1cm de diámetro y 2cm de largo y en el borde el número y tipo de muestra.

·         Gire la lámina y coloque una gotita de solución salina estéril sobre el área circular marcada al reverso de la lámina.

·         Con un aplicador de madera tome una colonia a partir del microorganismo a estudiar. Los frotis delgados son los mejores resultados.

·         Fíjela al calor, pasándola ligeramente por la llama, no calentar excesivamente. Una buena indicación del grado de calentamiento, es que al tocar el reverso de la lámina con su mano no debe quemarse

·         Coloque la lámina en el puente de tinción

Técnica de tinción:

·         Colóquese los guantes y ubicar las láminas extendidas y fijarlas en una bandeja adecuada y cubrir su superficie con cristal violeta por un minuto. Lavar con agua destilada y escurrir,

·         Cubra la superficie de la lámina con la solución de Lugol por un minuto. Lavar con agua destilada y escurrir

·         Decolorar con Alcohol-acetona hasta que los bordes del frotis no desprenda más color azul (30 segundos). Lavar con agua destilada y escurrir.

·         Nota: Este es el paso más importante de la coloración ya que una excesiva adición del alcohol-acetona permite la salida del colorante primario de las células grampositivas.

·         Cubrir las láminas con safranina por 1 minuto. Lavar con agua destilada, escurrir y dejar secar a temperatura ambiente.

Observación  bajo el microscopio

La tinción de Gram aporta dos ideas básicas para la identificación “taxonómica” de las bacterias: la primera es el color que adquieren tras la tinción y la segunda es la forma que presentan las células bacterianas.

·         Colocar una gota de aceite de inmersión sobre las láminas teñidas y secas, examinaras bajo un microscopio de luz, utilizando el objetivo de inmersión (100X)

·         Observar varios campos hasta encontrar aquel, donde las células están adecuadamente separadas, para permitir la visualización de la morfología

CLASIFICACIÓN Y USO DE LOS ANTIMICROBIANOS - Goodman & Gilman

1.       Sulfonamidas (sulfanilamida, sulfadiazina, sulfametoxazol, sulfisoxazol, sulfacetamida, ácido paraaminobenzóico)

                Poseen muy diversas actividades antimicrobianas contra bacterias grampositivas y Gramnegativas. Sin embargo existe actualmente cada vez más y más cepas resistentes, disminuyendo su utilidad. En general éstas ejercen sólo un efecto bacteriostático y los mecanismos de defensa celulares y humorales del huésped son esenciales para erradicar finalmente la infección.

                Entre los microorganismos más sensibles in vitro  que suelen ser sensibles están Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, H. ducreyi, Nocardia, Actinomices, Chlamydia trachomatis. Previamente se utilizaba para tratar infecciones meningocócicas, pero en la actualidad la mayoría de las cepas de Neisseria meningitidis son resistentes.

                Mecanismo de acción: Son análogos estructurales y antagonistas competitivos del ácido para-aminobezoico (PABA) y por tal razón impiden a la bacteria el uso normal del PABA en la síntesis de ácido fólico. Sinergistas: Uno de los medicamentos más activos que muestra efecto sinérgico es el Trimetroprim (inhibidor competitivo potente) induciendo bloqueos seriados en la vía por la que los microorganismos sintetizan el tetrahidrofolato

®     Sulfametozaxol: Es de más lenta absorción por intestino y su excreción en orina en comparación al sulfisoxazol. Se administra por vía oral contra infecciones sistémicas y de vías urinarias.

Uso: Infecciones de vías urinarias: No constituyen elementos de primera opción en estos casos debido a la presencia alta de cepas con resistencia a las sulfonamidas. Siendo preferidos los compuestos de Trimetroprim-Sulfametoxazol

®     Trimetroprim-Sulfametoxazol (Clotrimoxazol):El Trimetroprim posee una potencia de 20 a 100 veces mayor que el sulfametoxazol. Casi todos los microorganismos Grampositivos y gramnegativos son sensibles al Trimetroprim, pero puede surgir resistencia de forma independiente (Pseudomona aeruginosa, Bacterioides fragilis y enterococos por lo común son resistentes) Existe aparición notable en la sensibilidad de Enterobacteriaceae al Trimetroprim en diversos sitios geográficos por la aparición amplia de resistencia mediada por plásmidos y transposones.

Espectro: Chlamydia diphtheriae y Neisseria meningitidis son sensibles, algunas cepas de S. pneumoniae son resistentes; 50-95% de S. aureus, S. epidermis, S. pyogenes, E. coli, Shigella y Salmonella  son inhibidas por el fármaco. Las cepas de Staphylococcus resistentes a la meticilina a pesar de que también lo son al Trimetroprim y sulfametozaxol por separado, pueden ser sensibles a ambos en combinación.

Mecanismo de acción: La actividad antimicrobiana de la combinación del Clotrimoxazol es consecuencia de su acción en dos fases de la vía enzimática en la síntesis del ácido tetrahidrofólico. La sulfonamida inhibe la incorporación del PABA en el ácido fólico y el trimetroprim evita la reducción del dihidrofolato en tetrahidrofolato.

Aplicaciones terapéuticas:

·         Infecciones de vías urinarias: El tratamiento de las infecciones no complicadas en vías urinarias inferiores suele ser muy eficaz.

·         Infecciones bacterianas de vías respiratorias: Es eficaz en exacerbaciones agudas de bronquitis crónica por H. influenzae y S. pneumoniae.

·         Infecciones de tubo digestivo: Ha sido utilizado para combatir la shigelosis y tifoidea.

2.       Quinolonas (Ácido nalidíxico, Cinoxacina, Norfloxacina, Ofloxacina, Esparfloxacina, Lomefloxacina, Fleroxacina, Pefloxacina, Amifloxacina)

Mecanismo de acción: Estos fármacos inhiben el superenrrollamiento del ADN mediado por la girasa a concentraciones que guardan relación neta con las necesarias para inhibir la proliferación bacteriana.

Espectro antibacteriano:

®     El Ácido nalidíxico y la Cinoxacina son germicidas de casi todas las bacterias Gramnegativas comunes que causan infecciones de vías urinarias, pero su actividad intrínseca es limitada (Pseudomona aeruginosa es resistente)

®     Fluoroquinolonas: muestran actividad bactericida rápida in vitro y mucho más potentes contra E. coli y varias especies de Salmonella, Shigella, Enterobacter, Campylobacter y Neisseria.

®     Ciprofloxacina es más activa que la norfloxacina contra Pseudomona aeruginosa, enterococos y neumococos

Aplicaciones terapéticas:

·         Infección de vías urinarias: El á. nalidíxico y cinoxacina son útiles solamente en infecciones de vías urinarias contra microorganismos sensibles. Estudios clínicos comparativos señalan que  Norfloxacina, Ciprofloxacina, Ofloxacina y Clotrimoxazol son iguales de eficaces en el tratamiento.

·         Prostatitis

·         Enfermedades venéreas: No activas contra Treponema pallidum  pero tienen in vitro actividad contra Neisseria gonorrhoeae, C. trachomatis y H. ducreyi. Es importante recordar que las Quinolonas están contraindicadas en el embarazo.

·         Infecciones de tubo degestivo y abdomen: En el caso de diarrea del viajero (por cepas de E. coli  enterotoxigénica). La utilidad de las quinolonas es igual a la del trimetropim-sulfametoxazol y disminuye la diarrea.

·         Infecciones de vías respiratorias: Poseen poca actividad in vitro contra S. pneumoniae  y bacterias anaerobias. Por lo demás las fluoroquinolonas poseen  una actividad in vitro contra el resto de los gérmenes comunes (H. influenzae, S. aureus.

3.       β-Lactámicos

B-Lactámicos ejerce una acción bactericida por alterar la pared celular bacteriana. Su acción se desarrolla fundamentalmente en la última fase de la síntesis de peptidoglicano indispensable en la formación de la pared celular bacteriana. Las bacterias sin su pared estallan o son fácilmente fagocitadas por los granulocitos.

a.       Penicilinas

®     La penicilina G y su congénere cercano, penicilina V, son fuertemente activas contra cepas sensibles de cocos Grampositivos, pero sufren hidrólisis fácilmente por la penicilinasa. Por tal razón, estos compuestos son ineficaces  contra casi todas las cepas de Staphylococcus aureus. Uso: infecciones por neumococo (sigue siendo el medicamento más indicado para tratar infecciones por cepas sensibles de S. pneumoniae.); infecciones estreptocócicas (trastornos producidos por  S. pyogenes); infecciones por meningococos (el fármaco más indicado); infecciones por gonococos; sífilis;

®     Las penicilinas resistentes a la penicilinasa (meticilina, nafcilina, Oxacilina, cloxacilina y dicloxacilina) generan efectos antimicrobianos menos potentes contra microorganismos  sensibles a penicilina G, pero son eficaces contra S. aureus productor de penicilinasa

®     Ampicilina, amoxicilina, bacampicilina y otras más comprenden el grupo cuya actividad antimicrobiana se ha extendido para abarcar microorganismos gramnegativos como H. influenzae, E. coli y Proteus mirabilis. Los fármacos de esta categoría y otros más se señalan que son hidrolizados fácilmente por B-lactamasas de amplio espectro que han surgido con frecuencia cada vez más en cepas clínicas de estas bacterias Gramnegativas. Uso: En infecciones de vías urinarias (E. coli); meningitis (S. pneumoniae, N. meningitidis, H. influenzae); infecciones por Salmonella

®     La actividad antimicrobiana de carbenicilina y ticarcilina se han extendido para acabar con Pseudomonas, Enterobacter y especies de Proteus.

®     Otras penicilinas de espectro amplio incluyen mezlocilina y piperacilina que poseen actividad antimicrobiana útil contra  Pseudomonas, Klebsiella y algunos otros microorganismos gramnegativos

b.      Cefalosporinas

®     Cefalosporinas de 1ra generación: Ejemplificada por Cefalotina y Cefazolina, tienen actividad satisfactoria contra bacterias grampositivas y acción moderada contra Gramnegativas. Casi todos los cocos Grampositivos (a excepción de S. aureus y  S. epidermis) son sensibles. Muchos anaerobios de la cavidad oral son sensibles, pero el grupo B. fragilis es resistente.

®     Cefalosporinas de 2da generación: (Ejemplares como la Cefoxitina, Cefuroxima) Tienen acción un poco mayor con gramnegativos, pero mucho menor que los compuestos de la 3ra generación.

®     Cefalosporinas de 3ra generación: (Ejemplares: como Cefotaxima, Ceftriaxona, Ceftazidime) Casi siempre son menos activas que los medicamentos de la primera generación contra cocos Grampositivos, pero son mucho más activas contra Enterobacteriaceae que incluyan cepas productoras de B-lactamasa; Ceftazidime y Cefoperazona también es activo contra Pseudomona aeruginosa, pero no es lo es tanto en comparación con otros compuestos de la 3ra generación contra cocos Grampositivos.

®     Cefalosporinas de 4ta generación: Como a cefepima, presentan un espectro ampliado en comparación con las de 3ra generación y una mayor estabilidad contra hidrólisis frente a B-lactamasa mediado por plásmidos o cromosomas. Estos pueden ser  particularmente útiles en terapéutica de infecciones por bacilos gramnegativos aerobios resistentes a las cefalosporinas de la 3ra generación

c.       Carbapenems

®     Imipenem: Es el medicamento más activo que se dispone  in vitro contra muchas bacterias diversas. Se distribuye con Cilastina, que inhibe la degradación de dicho fármaco por la dipeptidasa  en túbulos renales. Es muy sensible a la hidrólisis de casi todas las B-lactamasas. Excelente contra muchos aerobios y anaerobios. Su actividad contra Enterobacteriaceae es excelente. Estreptococos, enterococos son sensibles.

®     Meropenem: No necesita se administrado junto con Cilastina porque no es sensible a la dipeptidasa renal. Su acción in vitro es similar a la del Imipenem y es activo contra algunas cepas de  Pseudomona aeruginosa  resistentes a Imipenem, pero muestran menor actividad contra Grampositivos

®     Aztreonam: Su acción antimicrobiana difiere de los otros B-lactámicos y se asemeja muy íntimamente a la de un aminoglucósido. Las bacteria grampositivas y loa anaerobios son resistentes. Es excelente contra Enterobacteriaceae, Pseudomona aeruginosa, también contra H. influenzae y gonococos.

d.      Inhibidores de B-lactamasas

Tienen mayor actividad contra B-lactamasas codificadas por plásmidos.

®     Ácido clavulánico: Tienen muy poca actividad antimicrobiana intrínseca, pero es un inhibidor suicida de B-lactamasas producidas por Grampositivos y gramnegativos. Normalmente se asocia con amoxicilina.

®     Sulbactam: Posee una actividad satisfactoria contra cocos Grampositivos que incluye S. aureus , aerobios gramnegativos (pero no  Pseudomona)

®     Tazobactam: Tiene poca acción contra B-lactamasas cromosómicas inductibles de Enterobacteriaceae .

4.       Aminoglucósidos

Mecanismo de acción: Son bactericidas rápidos que inhiben la síntesis proteica al unirse de manera irreversible a la subunidad 30S del ribosoma bacteriano y probablemente tengan otros efectos aún no totalmente aclarados. La destrucción de la bacteria depende de la concentración, y cuanto mayor sea esta, mayor es la rapidez con que destruye a los microorganismos.

®     Gentamicina: Es un compuesto importante para tratar muchas infecciones graves por bacilos gramnegativos.

·         Infecciones de vías urinarias: Usado pero en las infecciones no complicadas

·         Neumonía: Causada por bacilos gramnegativos, especialmente en personas hospitalizadas, individuos unidos a respiradores y en quienes tienen disminución de las defensas. Existen cepas resistentes de  Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Proteus y Pseudomona.  

·         Meningitis: La utilidad de las cefalosporinas de la 3ra generación  ha disminuido la necesidad  de usar aminoglucósidos en casi todos los casos excepto en  cepas infrecuentes y resistentes (p.e. Pseudomona y Acinetobacter).

·         Peritonitis

·         Infecciones por Grampositivos: Es de uso excesivamente crítico (para salvar la vida.

®     Estreptomicina: Se usa asociada a otros antibióticos. Asociada a tetraciclina o doxiciclina en el tratamiento de brucelosis. En la tuberculosis se la emplea asociada a otras drogas antituberculosas.

®     Tobramicina: Su actividad antimicrobiana es muy semejante a la Gentamicina. La actividad superior contra Pseudomona aeruginosa tal vez la vuelvan conveniente en el tratamiendo de bacteremia, osteomelitis y neumonía.

®     Amikacina: Su espectro es el más amplio de todo el grupo. Es el preferido en las infecciones nosocomiales graves por bacilos gramnegativos. Es cativo contra casi todas las especies de Klebsiella, Enterobacter  y  E. coli  que son resistentes a la tobramicina y a la Gentamicina.

®     Netilmicina: Es un antibiótico útil en el tratamiento de infecciones graves por enterobacterias y otros bacilos gramnegativos aerobios, sensibles.

®     Kanamicina: Posee un espectro antimicrobiano escaso o limitado en comparación con otros aminoglucósidos. Se ha usado para tratar tuberculosis en combinación con otros fármacos más eficaces.

®     Neomicina: Es de amplio espectro. Entre las especies muy sensibles de gramnegativos están  E. coli, Enterobacter aerogenes, Kebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris. Los microorganismos Grampositivos inhibidos incluyen  S. aureus y E. faecalis.

5.       Tetraciclinas

Tienen efecto bacteriostático. Inhibe la síntesis proteínica en el ribosoma de la bacteria al unirse a la subunidad 30S  del ribosoma y no permitir la unión del ácido ribonucleico. Alteran la membrana citoplasmática de organismos  susceptibles, permitiendo la salida de los componentes intracelulares.

Bacterias: En términos generales, los microorganismos Grampositivos son afectados por menores concentraciones de tetraciclina que las especies Gramnegativas.

Aplicaciones terapéuticas:

·         Chlamydia: Doxiciclina para el linfogranuloma venéreo, para tratar tracoma

·         Infecciones bacilares: Son eficaces en infecciones agudas y crónicas por  Brucella melitensis, B. suis, B. abortus. La OMS recomienda que se asocie doxiciclina con Rifampicina, o simplemente tetraciclina.

·         Infecciones por cocos: No están indicadas para las infecciones por estreptococos, estafilococos o meningococos.

·         Infecciones en vías urinarias: Su utilidad ha disminuido. No son activos contra  Pseudomona aeruginosa, ni contra  Proteus.  Se utilizarán solamente en el caso que se sepa que la cepa es realmente sensible.

6.       Cloranfenicol

Mecanismo de acción: inhibe la síntesis proteínica en bacterias y en menos extensión en células eucarióticas. Penetra fácilmente a la bacteria por difusión facilitada  y actúa más bien al unirse de manera reversible a la subunidad ribosómica 50S (Establece inhibición competitiva con los macrólidos y la Clindamicina)

Aplicaciones terapéuticas: Es importante utilizar el cloranfenicol en infecciones en que sus beneficios excedan los riesgos de toxicidades posibles.

·         Fiebre tifoidea: Fármaco importante para su tratamiento y otro tipo de salmonelosis sistémicas. En términos de unas horas de administrar Cloranfenicol, desaparece S. typhi en la sangre y en cuestión de días se vuelven negativos los cultivos en heces

·         Meningitis bacteriana: En las causados por H. influenzae, pero ha sido sustituido su uso por cefalosporinas como Cefotaxima y Ceftriaxona en el caso de terapéutica inicial de la sospecha de meningitis por H. influenzae

·         Infecciones por anaerobios: Es eficaz contra casi todas las bacterias anaerobias. Éste se usa en combinación con Penicilina en el tratamiento de abscesos cerebrales.

7.       Macrólidos

Mecanismo de acción: Inhiben la síntesis proteínica mediante la unión a la subunidad ribosomal 50S, inhibiendo la translocación del aminoacil ARNt. Tiene también efectos sobre la peptidil transferasa. Sus acciones pueden provocar un efecto bacteriostático o bactericida según la especie bacteriana atacada, concentración del antibiótico alcanzada o la fase de crecimiento  en que se encuentran las bacterias durante el ataque del antibiótico. Estos tienen su efecto  sólo en los microorganismos que se encuentran en proceso de replicación, penetrando más fácilmente  a las bacterias grampositivas

        Aplicaciones terapéuticas:

·         Infecciones por Chlamydia: Se trata con cualquiera de los macrólidos. Pero se recomienda de forma específica la Azitromicina  en vez de la doxiciclina en personas con infecciones uretrales, endocervicales, rectales. En e embarazo se recomienda mejor Eritromicina.

·         Difteria: La Eritromicina es muy eficaz para erradicar el estado de portador agudo o crónico de los bacilos diftéricos

·         Tos ferina: Eritromicina es el fármaco más adecuado para tratar infecciones por  Bordetella pertussis, se administra al comienzo de la tos ferina, acortando la duración del cuadro clínico.

·         Infecciones estreptocócicas: Faringitis, escarlatina y las erisipelas producidas por S. pyogenes involucionan con los macrólidos, evitando la aparición de complicaciones supurativas.

·         Infecciones estafilocócicas: Eritromicina es un compuesto alternativo para tratar infecciones relativamente menores causadas por S. aureus sensible o resistente a penicilinas.

·         Infecciones por Campylobacter: Eritromicina ayuda a erradicar Campylobacteer jejuni de las heces en el tratamiento de la gastroenteritis causadas por éste.

·         Tétanos: Puede erradicar a Clostridium tetani  en personas con tétanos y que son alérgicas a las penicilinas

·         Sífilis: Eritromicina se ha usado para tratar enfermos con sífilis temprana en individuos alérgicos a las penicilinas.

·         Gonorre: Usados para el tratamiento de la uretritis gonocócica, especialmente Eritromicina

8.       Clindamicina

Mecanismo de acción: Se liga exclusivamente a la subunidad ribosómica 50S bacteriana y suprime la síntesis proteínica. Se ha detectado resistencia a la Clindamicina y Eritromicina mediad por plásmidos y posiblemente se deba a la metilación del ARN.

Aplicaciones terapéuticas: Clindamicina es activa en contra de la mayoría de las bacteria grampositivas. Son sensible S. aureus, S. pyogenes, S. pneumoniae, S. viridans, S. bovis,  Clostridium tetani. S. feacalis  es resistente.  Su activad antibacteriana  es similar a la Eritromicina en contra de estafilococos y estreptococos, además efectivas contra anaerobios como B. fragilis. Está indicada para el tratamiento de acné vulgar, periodontitis, profilaxis para endocarditis bacteriana en pacientes alérgicos a la penicilina, vaginosis bacteriana como alternativa al metronidazol , infecciones por Chlamydia, profilaxis en cirugía de cabeza, cuello y abdominal con riesgo de contaminación.

9.       Vancomicina

Mecanismo de acción: Inhibe la síntesis de la pared celular en bacterias sensibles, impidiendo la síntesis principalmente del peptidoglicano. Es fundamentalmente contra bacterias grampositivas.

Aplicaciones terapéuticas: Debe utilizarse para combatir sólo infecciones graves y es particularmente útil en las causadas por estafilococos resistentes a meticilinas (incluida neumonía, empiema, endocarditis, osteomielitis y a abscesos de tejidos blandos). Extraordinariamente útil en infecciones estafilocócicas en  pacientes alérgicos a las penicilinas y a las cefalosporinas, sin embargo su acción es menos rápida que cualquiera de  los B-lactámicos.

10.   Rifampicina

Inhibe la ARN polimerasa dependiente del ADN. Es un Antibiótico sistémico, antituberculoso, bactericida, inhibiendo la síntesis del ARN bacteriano

Aplicaciones terapéuticas: Tuberculosis en todas sus formas, brucelosis, erradicación de meningococos en portadores asintomáticos, no enfermos. Alérgicos o con contraindicaciones a otros antibióticos. Infecciones causadas por estafilococos (S. aureus, S. epidermidis, cepas polirresistentes)  y por enterococos.

Tinción de Ziehl Neelsen

Fundamento:

Las paredes celulares de ciertas bacterias contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50-90 átomos de C) que les confieren la propiedad de resistir a la decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistentes (o ácidorresistentes). Las micobacterias como Mycobacterium tuberculosis y M. marinum se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere de calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el calentamiento aumenta la energía cinética de las moléculas del colorante lo cual también facilita su entrada a las bacterias. Las bacterias que resisten la decoloración son de color rojo, sobre un color azul (que lo provee el colorante de contraste Azul de metileno).

Procedimiento:

Frotis:

1.         Colocar los frascos con las muestras en orden consecutivo de izquierda a derecha

2.       Poner las láminas en la mesa (en este caso dentro de la CSB) y numerarlas con los números correspondientes a las muestras usando 1/3 de la lámina al reverso (para que al momento de hacer la decoloración no se borre)

3.       Abrir el frasco de la muestra de manera firme y lenta

4.       Ver el contenido del frasco y obtener la parte más purulenta

5.       Con un palillo de madera escoger la porción más purulenta/sanguinolenta/sólida, no se debe batir demasiado la muestra

6.       Extender la muestra en un frotis de una capa no muy gruesa (sobre loso 2/3 de lámina sobrante) sin llegar a los bordes

7.       Si es necesario, desmenuzar las partículas grandes con las puntas del palillo de madera quebrado por la mitad

8.       Desechar el aplicador en un frasco de boca ancha con alcohol o cloro

9.       Dejar secar el frotis

10.    Tomar la lámina por el extremo numerado con la muestra hacia arriba, pasarla tres veces por la llama del mechero para fijar el frotis, dejar enfriar el frotis (2-3 min.)

Tinción:

1.         Cubrir todo el porta-objeto con fucsina filtrada

2.       Calentar hasta la emisión de vapores (aprox. 5 min.)

3.       Lavar con agua (poniendo la lámina de una manera inclinada para evitar barrer la muestra) y escurrir

4.       Cubrir con solución decolorante durante 2 min.

5.       Lavar con agua (poniendo la lámina de una manera inclinada para evitar barrer la muestra) y escurrir

6.       Cubrir con azul de metileno de 45seg.-1min.

7.       Lavar con agua y luego poner en la tabla de secado (para escurrir)

Reporte de resultados:

Informe	Número de BAAR
Negativo (-)	No se observaron BAAR en 100 campos observados (C.O.)
No. Exacto de bacilos	Se observan de 1-9 BAAR en 100 C.O.
Positivo (1+)	Se observa de 10-99 BAAR en 100 C.O.
Positivo (2+)	Se observa de 1-10  BAAR x campo en 50 C.O.
Positivo (3+)	Se observa más de 10 BAAR x campo en 20 C.O.

Trichosporon beigelii

Las micosis superficiales atacan la piel, los pelos y las uñas, estas pueden ser crónicas y resistentes al tratamiento pero rara vez afectan la salud general del enfermo, no invaden tejidos profundos. Entre los hongos que causan este tipo de infección están los dermatofitos, que atacan la capa córnea de piel y faneras, y estos son de amplia diseminación mundial, que suelen encontrarse en el suelo y provocar infecciones en animales domésticos y de allí transmitirlas al hombre. Causan entre otras micosis, la tiña y el pié de atleta. Otros atacan exclusivamente la porción extrafolicular de los pelos del cuero cabelludo, formando nódulos a su alrededor que se caracterizan por su aspecto duros, ser negros, brillantes y visibles a simple vista, esta micosis es conocida como Piedra negra, causada por Piedraia hortai. Pero cuando los nódulos son blanquecinos y atacan pelos del cuero cabelludo, barba, bigote e incluso vello del pubis se denomina Piedra blanca, cuyo agente etiológico es Trichosporon beigelii. (Saber de Ciencias, 2013)

                La piedra blanca fue descrita por primera vez por Beigeli en 1865. Sin embargo, la diferenciación entre la piedra negra (Piedraia hortai) y piedra blanca (Trichosporon beigelii) no fue hecha hasta 1911 por Horta y Brumat; se le dio el nombre de Trichosporon en 1913 (Dr. Herrera & Dr. Moya, 1995)

También la Piedra blanca se ha conocido a lo largo de  la historia con diferentes nombres como “Enfermedad de Beigel”, “Tinea nodosa” y también como “Piedra alba” y se ha descrito como una micosis superficial tipo nodular de los cabellos (cabello en general), poco contagiosa, favorecida por la humedad y ocasionada ya dicho antes por Trichosporon beigelii.

                Así, a partir del presente trabajo se pretenden desarrollar los aspectos de Agente etiológico (morfología), patología, diagnóstico, tratamiento y epidemiología.

Agente etiológico (Morfología)

               

Trichosporon beigelii fue clasificado en la familia Cryptococcaceae; sin embargo, se le han encontrado características comunes con los miembros de la subdivisión Basidiomycotina, como son la presencia de xilosa en su pared, el hallazgo de que sus septos son doliporos y que presenta antígenos comunes con Filobasidiella neoformans, la fase teleomórfica de Cryptococcus neoformans. También, se ha sugerido con base en pruebas de hibridación con ADN, que en realidad T. beigelii representa un complejo de seis especies.

T beigelii es un hongo de crecimiento intermedio; la colonia joven es blanca con el centro ligeramente elevado. Si el aislamiento se hace a partir de sangre o de un tejido inoculado en agar sangre, el aspecto de esas colonias inicialmente hace pensar en Candida. Sin embargo, a medida que envejece la colonia toma una coloración pardusca, que se acentúa en el centro, el cual se eleva más y la superficie de la colonia se torna plegada. Las colonias de Trichosporon son levaduriformes, de rápido crecimiento, lisas, glabrosas o vellosas, blancas o blanco amarillentas o color crema. Son ureasa positiva.

Microscópicamente la superficie de la colonia está cubierta por blastosporas y artroblastosporas (artrosporas), ya que el extremo de las hifas se fragmenta. Por lo tanto, la observación de estos elementos orienta la identificación del agente. En agar a 25°C, luego de 72 h de incubación, Trichosporon produce abundantes pseudohifas e hifas, las blastoconidias son unicelulares y de forma variable, la más típica imagen microscópica del género es la producción de artroconidias usualmente cúbicas o en forma de barril. Y debe diferenciarse de Candida y Geotrichum, difiere de Candida por la producción de artroconidias y de Geotrichum por tener blastosporas. (FBA)

Generalmente se dice que es levaduriforme artrosporado, que pertenece a los Deuteromycetes y que forma parte de la familia Cryptococcaceae. (Dr. Herrera & Dr. Moya, 1995)

                Trichosporon beigelii, levadura asexuada, saprófito del agua, suelo, agua, desechos industriales, frutas, vegetales animales o sus excretas de humanos (Torres González, 2005). Esta levadura saprófita puede llegar a comportarse como oportunista, teniendo como prerrequisito para su infección, factores predisponentes o sistema inmunológico disminuido para que pueda producir enfermedad que incluso puede llegar a ser diseminada.

Patología

Esta infección se caracteriza por la presencia de una masa de hongos de aspecto grasoso, consistencia blanda y un color blanco o pardo claro del tamaño de la cabeza de un alfiler (Pueden desprenderse con facilidad, lo cual ayuda a diferenciarlos de las liendres. (Salud)). La infección puede iniciarse debajo de la cutícula, posiblemente después de una lesión y se ven afectados los pelos de cuero cabelludo y pubis (menos frecuentemente de barba y bigote). El desarrollo del nódulo se inicia alrededor del tallo piloso, formando un entretejido de hifas que se fragmentan y forman artroconidias levaduriformes. (Dr. Herrera & Dr. Moya, 1995)

El hallazgo de este hongo causando enfermedades sistémicas es poco común, pero cada vez los casos son más frecuentes y están relacionados con alta mortalidad, por el hecho que T. beigelii se reporta como resistente a la Anfotericina B, uno de los mejores antimicóticos con los que se cuenta para el tratamiento de infecciones invasivas. (Dr. Herrera & Dr. Moya, 1995)

Se sospecha que la principal puerta de entrada al organismo es el tracto digestivo o la vía aerógena, lo cual se correlaciona con el hallazgo de colonización intestinal y pulmonar (Esto en caso de la infección sistémica)

Diagnóstico

Diagnóstico de laboratorio

·         Examen directo:

o   Los vellos afectados se tratan con KOH al 10% o al 20%. El KOH es queratolítico, digiere la queratina tanto la presente en la piel como en el cabello. Luego se observan al microscopio. Se pueden observar filamentos que al fragmentarse forman artroconidias, que se pueden unir en posiciones poliédricas muy características. Además de las artroconidias se pueden observar elementos redondos que adoptarán posiciones poliédricas también. La parasitación es ectrotrix (se encuentra afuera): el pelo no está afectado hasta la corteza. Cuando los nódulos se unen, se forma una masa en el cabello. Al tomar un nódulo o un cabello parasitado y tratarlo con KOH, los filamentos o artroconidias son hialinos (transparentes). Los nódulos en la Piedra Blanca son hialinos y blandos; en el caso de Piedra Negra el nódulo es duro y los elementos hifales son oscuros. (Nolasco Morales)

o   La observación clínica de las lesiones muchas veces es suficiente para realizar el diagnóstico. Si tiene a la mano una luz de Wood, esta puede serle de ayuda, ya que en algunos casos la piedra blanca fluoresce blanco — amarillento o amarillo —verdoso. (Salud)

·         Cultivo

o   Agar glucosado Sabouraud (cloranfenicol & Actibiona): En un agar el cloranfenicol y la Actibiona hacen los medios selectivos (inhibidores: la Actibiona inhibe hongos contaminantes y el cloranfenicol inhibe bacterias contaminantes). Se incuba a temperatura ambiente. Pasados 10 días se observan colonias cremosas con apariencia de mantequilla, de color blanquecino, y con el centro plegado o cerebriforme. Tienen 1 cm de diámetro. Al hacer una preparación de estas colonias se van a ver elementos hialinos tabicados, elementos fúngicos transparentes que se pueden fragmentar. (Nolasco Morales)

·         Sistema Automatizado

o    Vitek con un periodo de incubación de 48 horas a 30ºC (Dr. Herrera & Dr. Moya, 1995)

o   La identificación final de este agente se puede hacer mediante pruebas de fermentación de carbohidratos, lo cual puede hacerse con sistemas miniaturizados semiautomáticos como el API-20C AUX (BioMerieux) (Rivera & Hernandez, 2003)

·         Las pruebas de sensibilidad a antimicrobiana

Se pueden realizar siguiendo la metodología del ATB-F4ngus de la casa BioMerieux; que consiste en hacer una suspensión del hongo en solución salina a una concentración equivalente a la turbidez del tubo N° 2 del nefelómetro de McFarlane e inocularla en las bandejas que contienen 5-Fluorocitocina, anfotericina ,B, nistatina, miconasol, econasol ketoconasol. EI crecimiento en las diferentes celdillas indica la sensibilidad a estas drogas. (Dr. Herrera & Dr. Moya, 1995)

Epidemiología

Predomina en áreas tropicales y es más frecuente en varones jóvenes. Se ha descrito una susceptibilidad individual a la infección y aunque se han descrito casos familiares, es una enfermedad podo contagiosa. Favorecen el desarrollo de la infección, la humedad, la diabetes, el uso de peines, cepillos o brochas contaminados y probablemente la infección VIH/SIDA [puede afectar a hospederos inmunocomprometidos leucopénicos/con leucemia, pacientes tratados con corticosteroides, la implantación de prótesis en válvulas cardíacas, la hemacromatosis (Rivera & Hernandez, 2003)]. No son definitivas las pruebas acerca de la vía sexual como medio de transmisión, pero la presencia del hongo en la región perianal, y la existencia de portadores asintomáticos homosexuales mantienen la sospecha. (Salud) Este hongo es comúnmente aislado del suelo y aguas en zonas tropicales y ocasionalmente se encuentra como parte de la flora micótica de piel, uñas y boca.

Tratamiento

·         Se recomienda buena higiene de los sitios comprometidos y muchas veces el corte, rasurado, o depilación dependiendo del sitio afectado. También se recomienda evitar la humedad del cabello (dejándolo suelto luego del lavado) y de las zonas afectadas.

·         Fungicidas tópicos: Miconazol, Ketoconazol

·         No olvidar la participación de los fómites (ropa interior, cepillos, etc.) en la reinfección. Se recomienda realizar una desinfección adecuada de estos o evitar su uso.

(Salud)